Potenciál vodíku , nebo pH , jemíra kyselosti nebo zásaditosti kapaliny . Je důležité v mnoha oblastech , včetně biologie, chemie a vědy o životním prostředí . Měření pH je jednoduché, ve většině situací . Lakmusový papírek může být vložena do kapaliny , azměna barvy papíru označuje míru, do které je tekutina kyseliny nebo báze . V případech, kdy je tekutina , které se zkoušejí je uvnitř buňky , jiné metody mají být devised.Things budete potřebovat celým 2 ‚ , 7‘- bis – ( 2 = karboxyethyl ) -5 ( a -6 ) – karboxyfluorescein ( BCECF ) , nebo jiné látky , která má různé fluorescenci za různých podmínek pH
fluorescenční spektrofotometr s dvojitým monochromátorů , nebo podobný nástroj pro měření fluorescence
Odstředivka
předem stanovené kalibrační křivky měření korelace intracelulární BCECF a cytoplazmatické pH
Zobrazit další instrukce
1
ochladit teplotu vzorku buněk na 41 až 50 stupňů Celsia . To umožňuje lepší absorpce fluorescenčního materiálu buněk .
2
Vložte vzorek buněk s fluorescenčním vyvolávající látky , jako BCECF . To se provádí přidáním BCECF k buněčné médium , poté za stálého míchání se směs opatrně po dobu 2,5 hodiny . BCECF se vstřebává přes propustnou membránu buněk .
3
Oddělte buněk z média a jakékoliv neabsorbovaného BCECF spuštěním vzorku pomocí odstředivky . Vložit buňky do jiné nádoby .
4
zahřívá vzorek buněk na 98,6 stupňů Celsia po dobu 30 minut , se sbližují podmínky v lidském těle . Jsou-li buňky zkoumané normálně žijí v nějakém jiném prostředí, než je lidské tělo , upravit vzorek na vhodnou teplotu .
5
rozrušit vzorek buněk mícháním . To přispívá ke zvýšení fluorescenční aktivitu .
6
Změřte intenzitu fluorescence vzorku buněk pomocí spektrofotometru . Pro dosažení nejlepších výsledků , použijte excitační světlo na vlnové délce 500-510 nanometrů . Na těchto vlnových délkách , jevětší rozšíření intenzity fluorescence , takže je snazší odlišení výsledků . Intenzita fluorescence se měří v relativních fluorescenčních jednotek ( RFU ) ,poměr jasu látky v vzrušeném , fluorescenční stavu do normálního , unexcited stavu . Čím vyššíRFU ,jasnějšílátka , ve srovnání s normálním stavu .
7
Porovnání výsledků spektrofotometru pre – tažené kalibrační křivky . Obecně platí, že vyšší fluorescenční , tím vyšší hodnotu pH ve vzorku . S excitační vlnové délce 510 nm ,substance s pH 6,4 se ukazují RFU asi 20 , zatímco látka s pH 9,9 se ukazují RFU asi 55 .