Sangerova činidlo se používá k určení sekvence aminokyselin , které tvoří peptid . Činidlo zapadne na – nebo tag – aminokyselinu na samém konci peptidového řetězce , také známý jako N -konci . Peptid pak může být rozdělena do kusů ( hydrolyzuje ) a jednotlivé aminokyseliny zkoumat pomocí různých metod chromatografie . Bez ohledu na aminokyselina neseznačka jejedním koncem . Sangerova činidlo je také známý jako dinitrofluorobenzene ( DNFB ) . Jakmile je nakloněný na aminokyseliny , to je odkazoval se na jako DNP – compound.Things budete potřebovat klipart laboratorním měřítku
Rukavice
Ochranné brýle
odstředivka
Centrifugujte
Pasteur pipety
destilovaná voda
4,2 % roztokem hydrogenuhličitanu sodného
Sanger činidlo ( FDNB )
pH papíru
diethyletheru
6M roztoku kyseliny chlorovodíkové
acetonu
test trubice
Zobrazit další instrukce dovolená 1
naváží 3 miligramů peptidu na stupnici . Umístěte ji do centrifugační zkumavky . Přidá se přibližně 0,3 ml vody , 0,3 ml reagentu Sanger a 0,075 ml hydrogenuhličitanu sodného .
2.
Nechte centrifugační zkumavky inkubovat při pokojové teplotě po dobu jedné hodiny . Během inkubace , protřepe trubice opatrně , aby se zabránilo směsi z oddělení . Zkontrolujte pH roztoku každých 15 minut s pH papíru. Hodnota pH by měla být vyšší než 9 . Pokud začne klesat , přidá se malé množství hydrogenuhličitanu sodného ( přibližně jedna kapka s Pasteurovou pipetou ) .
3
Po inkubaci se přidá 1,5 ml vody astejné množství etheru . Roztok se rozdělí na vrstvy . Možná se budete muset odstředit směsi ji oddělit . Odstraňte Etherová vrstva (vrchní , žlutá vrstva ) se pipetou a vyhoďte ji .
4
Upravte pH až 1,0 pomalým přidáním kyseliny chlorovodíkové . Přidejte trochu kyseliny v době , jemně promíchejte , poté zkontrolujte pH pomocí pH papírku . Celkem by vyžadovat asi 0,15 ml kyseliny . PokudpH klesne pod 1,0 , přidá se malé množství ( ne více než kapka ) hydrogenuhličitanu sodného .
5
Přidají se 3 ml éteru . Nechtesměs oddělit . Nynívrchní vrstva (žlutá , éter vrstva ) obsahuje vaše DNP – sloučeniny . Pomocí pipety , pečlivě extrahovat tuto vrstvu a přenášet je do čisté zkumavky . Umístěte zkumavku stranou a nechtekapaliny vypařovat se , zanechala za sebousuché , žlutá pevná látka .
6
umyjte pevná s acetonem . Přidat 0,3 mililiters acetonu , jemně promíchejte a extrahovat kapalinu s pipetou . Přidejte 0,75 mililiters kyseliny do zkumavky . Váš peptid je nyní označen a připraven k hydrolyzuje a analyzovány metodou chromatografie dle vašeho výběru .