Jeden z nejběžnějších metod výpočtu koncentrace proteinu v laboratorním prostředí je použít Bradford testu. Bradford Reagent jekolorimetrické činidlo, které mění barvu na základě koncentrace bílkovin. Tím, že kombinuje známé standardní křivky pomocí Bradford Reagent , můžete vytvořit opatření , na které si můžete vypočítat koncentraci jakýkoliv protein , včetně antibodies.Things budete potřebovat klipart Upravená protilátky ve známém bufferu Buffer
odpovídající pozastavení protilátky
lyofilizovaného bovinního sérového albuminu (BSA)
Microcentrifge trubek
Laboratorní pero
vortexu
laboratorním měřítku
vážení papír
1 ml pipet
Bradford činidlo
multi- jamková destička
Colorimetric deska čtečky
Microsoft Excel
Lab knihy
Pen
Zobrazit další instrukce
vytvořit standardní
Stránka 1
Změřte 200 mg BSA na vážení papíru s použitím v laboratorním měřítku . Vložte jej do mikrozkumavky . Přidají se 2 ml pufru do mikrozkumavky obsahující 200 mg BSA. Označit tato trubka „1“
2
Vortex Tube 1 až BSA zcela nerozpustí .
3
Odstranit 500 ul BSA v pufru a přenosu se do druhé zkumavky . Označte tuto trubku “ 2. “ Přidat 500 ul obyčejného vyrovnávací paměti Tube 2.
4
Odstranit 200 ul BSA v pufru ze zkumavky 1 a přenést do nové zkumavky . Označte tuto trubku “ 3. “ Přidat 800 ul obyčejného vyrovnávací paměti Tube 3.
5
Odstranit 100 ul BSA v pufru ze zkumavky 1 a přenést do nové zkumavky . Označte tuto trubku “ 4. “ Přidat 900 ul obyčejného vyrovnávací paměti Tube 4.
6
Odstranit 10 ul BSA v pufru ze zkumavky 1 a přenést do nové zkumavky . Označte tuto trubku “ 5. “ Přidat 990 ul obyčejného vyrovnávací paměti Tube 5. Trubky 1- 5 zahrnují klasifikovaného standardní série . První trubka má známou koncentraci 100 mg /ml ; druhý , 50 mg /ml ; Třetí , 20 mg /ml ,čtvrtý , 10 mg /ml ; apátý , 1 mg /ml . Každá trubička obsahuje přibližně 1 ml roztoku .
Vytvoření protilátek Ředění
7
Přidat 5 0ul vyčištěné protilátky 95 0ul bufferu . Označte tuto trubku “ A. “
8
Přidat 10 ul vyčištěné protilátky 990 ul pufru . Označte tuto trubku “ B. “
9
přidat 2 ul purifikované protilátky 998 ul pufru . Označte tento trubice “ C “
klipart Vložte desku
10
Umístěte 0,5 ml obyčejného vyrovnávací paměti v prvních jamek ve dvou sloupcích okénky desky.
11
Umístěte 0,5 ml obsahu Tube 1 ve druhém jamek v prvních dvou sloupcích v multijamkových desce. Pokračovat na stupňující se sérii , dokud První dva sloupce obsahují 0,5 ml jednoho standardního roztoku BSA z každé trubky 1-5 , včetně jamky pro holý vyrovnávací paměti.
12
přidá 0,5 ml Bradford Reagent pro každého dobře . Kroužením desku míchat činidla s proteinových roztoků , dávejte pozor, abyste rozlití obsah žádné z jamek . Počkejte 5 minut .
13
Přečtěte si desku podle protokolu specifické pro vaše čtečky destiček při vlnové délce 595 nm.
Spočítejte protilátek Koncentrace
14
Kopírovat hodnoty přečtené z čtečky desky do aplikace Microsoft Excel.
15
Vytvořit graf ze dvou sloupců hodnot reprezentujících standardu BSA pomocí Průvodce grafem v aplikaci Microsoft Excel .
16
Plot body měřených od ředění protilátek v grafu aplikace Excel. Přečtěte si odpovídající koncentraci bílkovin v závislosti na hodnotě y – osy pro ředění protilátky bodu v grafu aplikace Excel.
17
V závislosti na tom, zda používáte hodnoty získané od metra A, B nebo C , vynásobte hodnotu buď 20 , 40 nebo 500 , resp . Výsledná hodnota je koncentrace vaší purifikované protilátky.