TOPO klonování jeproces klonování , která využívá obecně , 3 ‚ zbytky, které jsou termodynamicky nestabilní a kombinuje je s polymerázy Taq DNA. Kromě toho ,proces používá nový produkt, polymerázová řetězová reakce (PCR) , které musí být skladován při teplotě 4 ° C. Tato forma klonování optimalizuje aktivní topoisomerázy I molekuly přidané do konce lineárního vektoru . Chcete-li provést TOPO klonování , je třeba dodržovat určitá protokolu . Příprava
lze užívat některé základní kroky pro urychlení celkového TOPO klonovací proces a pomůže zajistit jeho úspěch . Za prvé, trubky životaschopných buněk by měly být umístěny na led k udržení jejich přijatelnost . Další , super optimální kultura ( SOC ) střední , bakteriální růst obohacené živinami , by měla být uvedena na pokojovou teplotu . Selektivní desky by pak měly být předehřáté na 37 stupňů Celsia , takže jsou plně připraveni, až přijde čas na jejich použití .
Kombinace Složení
Chcete-li začít klonování Způsob ,kombinace 2 mikrolitry polymerázové řetězové reakce ( PCR ) produktu , 0,5 ul solného roztoku a 0,5 mikrolitrů klonovacího vektoru by měla být kombinovány v 0,5 mililitrové centrifugační zkumavky . Poté, co v kombinaci , bude třeba nastavit na teplotu místnosti a nechá se inkubovat po dobu pět-desetminut tyto složky . Dále se kombinované složky přidán do “ Top- 10 chemicky kompetentních buněk “ v 50 – microliter zkumavky a umístí na led po dobu dalších deseti minut. Poté se buňky musí být tepelně šoku při teplotě 42 stupňů Celsia a přesně umístí na led po dobu další minutu, než se přidá 180 ul SOC média . Tato směs se poté třepe v horizontálním směru při 200 otáčkách za minutu po dobu další hodiny při teplotě 37 stupňů Celsia .
Závěrečné kroky
Směs 50 ul a 100 ul každé reakce by měly být naneseny “ na LB + AMP + X – Gal desek a inkubuje bez třepání přes noc při 37 ° C. “ Další den tři bílé kolonie z každé reakce by měla být vybral a umístěny ve 4 ml LB + AMP a ponecháno inkubovat přes noc při teplotě 37 stupňů Celsia , přičemž je protřepává při 200 otáčkách za minutu . Posledním krokem je mini- příprava plasmidů a čekají, zda tento proces byl úspěšný .