in vitro experimenty jsou prováděny mimo živý organismus ve zkumavce nebo podobném prostředí . Vědci mohou RNA kopie nebo přepisy genu in vitro prostřednictvím procesu nazývaného v transkripci in vitro . Enzym, který je RNA transkript na základě genu se nazýváRNA polymeráza . Jedna taková molekula jeSP6 polymerázy . To vyžaduje úsek DNA se nazývá SP6 promotor , aby správně fungoval . Předkladatelé
promotor jeoblast DNA vázána RNA polymerázou pro zahájení transkripce . SP6 polymerázy vyžadujevelmi specifická sekvence je přítomna v promotoru zavazující , takže když jeSP6 polymeráza používá pro in vitro transkripci , musí býtgen obsahovat SP6 promotor , aby došlo k transkripci . SP6 polymeráza je z typu viru s názvembakteriofága ; biotechnologické společnosti vyrábět tuto polymerázu tím, že nakazí bakterie Salmonella se fágů a následně izoluje polymerázu .
Expression
bazální exprese a aktivita se vztahuje k úrovni exprese v nepřítomnosti jiné molekuly, které zvýší nebo sníží na úroveň transkripce . Aktivátory nebo represory , například , jsou proteiny, které se vážou k promotoru nebo jiných regulačních oblastí genů a buď pomáhají při náboru RNA polymerázu , nebo zabránit tomu, aby z vazby . Induktory jsou molekuly , které zvyšují produkci genového produktu zvyšování úrovně exprese .
SP6
Bazální činnost pro SP6 promotor se bude lišit v závislosti na podmínkách váš experiment . Nejdůležitější úvahu , samozřejmě , je to, jak experimentálních podmínek může mít vliv na aktivitu a jak SP6 srovnání s jinými systémy . Obecně lze říci , SP6 polymerázy a promotéři dodat nižší účinnost než in vitro transkripčních systémů T7 nebo T3 , i když za ideálních podmínek SP6 je zhruba srovnatelný s těmito dvěma . Stejně jako SP6 , jak T7 a T3 použít RNA polymerázu z bakteriofága .
Podmínky
Salt koncentrace a teploty jsou dva důležité faktory při určování bazální aktivitu . SP6 je velmi citlivý na koncentraci soli , takže vyšší koncentrace soli může snížit svou činnost výrazně . Vše ostatní zůstává stejné , výraz je významně vyšší u 104 stupňů Fahrenheita , než na 99 stupňů Celsia . Koncentrace nukleotidů je dalším důležitým aspektem . Nízké koncentrace mohou potenciálně způsobit přepis ukončit předčasně , a tím snížit účinnost . Zvýšení koncentrace nukleotidů se tomuto problému vyhnout . Pokud jste syntetizovat RNA sond , ale s tím, příliš mnoho neznačenou nukleotid sníží množství značeného nukleotidu v konečném produktu .