patch- clamp experiment se používá k měření jednotlivé živých buněk . Dělá to s velmi jemnou pipetou úzce konala proti membráně v jediné buňky (vnější ochranný krycí ) . Otevření tohoto pipety je pouze asi 1 mikron ( tisícina milimetru ) a je řízen opticky pod mikroskopem . Buňky jsou uchovávány v jednotné misce pomocí mobilního detacher , jako je trypsin . Specifická buňka je vybrána apipety tip je umístěn na buněčné membráně . Utěsnění je tvořen pomocí sání a část membrány je vypracován do pipette.Things budete potřebovat klipart mobilní desku
fosfátový pufr nebo PBS ( bez vápníku a hořčíku )
Trypsin
inkubátor
10 mililitrů pipeta
HEK ( lidský epidermální keratinocyctes ) střední
fetální telecí sérum ( FCS )
odstředivka
externí řešení pro nahrávání
Patch clamp čip
Twist čepice
elektrod
Zobrazit další instrukce dovolená 1
získat talíř pro buňky . Dvakrát s 10 ml PBS ( fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) bez vápníku a hořčíkudesku umýt . Přidají se 2 ml detacher ( trypsin ) . Inkubujte destičku po dobu tří minut při teplotě 37 stupňů Celsia . Deska se pozoruje pod mikroskopem, aby bylo zajištěno , že buňky byly odděleny . Jemně přesunout desku odpojit všechny buňky ze spodní části desky . Přidá se 10 ml HEK ( lidské epidermální keratinocyctes ) a FCS ( fetální hovězí sérum ) média . Pomocí 10 ml pipety pro pohyb buňky nahoru a dolů .
2
Dodržujte buňky pod mikroskopem , aby se zajistilo, že jsou jednotlivé buňky . Odpipetuje pomocí 10 – ml pipety , dokud se buňky jsou jediné , v případě potřeby . Odstředivka buňky po dobu dvou minut při 1000 otáčkách za minutu . Odstraňte supernatant . Umístěte buněk v 10 ml fetálního telecího séra . Odstředivka buňky opět po dobu dvou minut při 1000 otáčkách za minutu . Odstraňte supernatant . Umístěte buňky ve 200 ul externí řešení pro nahrávání . Dodržujte buňky pod mikroskopem pro jednotlivé buňky s hladkou membránou .
3
umístěte solný roztok uvnitř patch clamp čipu . Přidejte kapku intracelulárního roztoku elektrolytu na spodní části čipu pomocí pipety . Namontujte čip na twist uzávěrem . Twist uzávěr by měl obsahovat referenční elektrodu a sací potrubí . Přidejte kapku extracelulárního roztoku elektrolytu k horní části čipu pomocí pipety . Roztok elektrolytu umožňuje čipu , aby se kontaktu s elektrodou . Přidá se 5 mikrolitrů buněčné suspenze do solného roztoku v čipu . Umístěte jednu buňku pomocí sání pomocí pipety . Sání může být provedeno ručně nasávání vzduchu přes pipety . Umístění odpor zvyšuje buněk pro vytvoření těsnění . Těsnění umožňuje vyšetřování celé buňky .