Gel filtrační kolony se používají k oddělení proteinů z komplexních směsí . Vzhledem k tomu, každý protein má unikátní molekulovou hmotnost , mohou být indukovány k separaci do různých vrstev migraci je přes filtrační kolonu obsahující rovnoměrné gelovou matrici . Chcete-li správně identifikovat každý protein , který je oddělen ven , budete muset kalibrovat sloupce pomocí několika proteinů známých molekulárních weight.Things budete potřebovat
karboanhydrázy
cytochrom c
Aprotinin
Bazální sůl
Centrifugujte
feritinu
Odstředivka
odpipetuje čerpací
250 ml odměrné válce
Buffer kapalina
Scientific čistící ubrousky klipart injekční stříkačky
Zobrazit další instrukce
1
Odstraňte lahvičky karboanhydrázy , cytochromu C a aprotininem z ledničky nebo mrazáku a umožní jim dosáhnout pokojové teploty . Přidají se 4 mg každého proteinu do centrifugační zkumavky na mililitr gelu na filtrační kolonu . Přidejte 961 MCL bazální soli na miligram proteinu do každé centrifugační zkumavky , aby se rozpustily proteiny . Přidat 39,2 MCL feritinu na mililitr gelu do každé zkumavky a promíchejte v odstředivce .
2
Vypněte filtraci sloupce čerpadlo a zavřete kohout na vstupu do kolony . Povolte , ale neodstraňujte , v horní části filtrační kolonu . Nastavte čerpadlo maximálního průtoku pro sloupce a znovu spustit čerpadlo , dokud se vyrovnávací materiál byl vypracován off . Zastavte čerpadlo .
3
Přidá se 1 ml každého proteinu filtrační kolony pomocí pipety čerpadla . Kapání proteinů se stanoví vnitřní sloupce z výšky 1 cm až 2 cm, práce kolem vnitřního okraje sloupce . Nechtesměs proteinů usadit v horní části gelové matrix .
4
Umístěte vypouštěcí hadice čerpadla do čisté , suché 250 ml odměrné válce . Restartování čerpadla rychlostí 0,30 ml za minutu a spustit proteinů do gelové matrice . I když je čerpadlo v chodu , důkladně po stranách trubice pomocí pipety čerpadla a malé množství pufru kapaliny . Jakmile proteiny zcela vstoupil do gelové matrice , snížit rychlost čerpadla na 0,02 ml za minutu a čerpadlo v 5 cm až 7 cm vrstvou pufru kapaliny v horní části matrice .
5
odpojit sloupec čepice z kohoutku . Vyčistěte kryt sloupku a uvnitř kolony vědecké čistící ubrousky . Znovu nainstalujte kryt sloupku . Naplňte vyrovnávací nádrž s vyrovnávacím kapalinou . Připojte injekční stříkačky do kohoutem a otevřete jej . Použijte odsávačku malé množství paměti pomocí hadičky a do stříkačky . Zavřete kohout a znovu ji do sloupce nahoře . Otevřete kohoutek a zkontrolujte těsnost .
6
Spusťte sloup na 0,02 ml za minutu po dobu několika dnů , dokudferitinu kapela se blíží konec kolony . Shromažďovat všechny filtrační gel, který je čerpána v odměrném válci .